Nieuwe methode voor volautomatische bepaling van de concentratie legionella
Nieuwe methode voor volautomatische bepaling van de concentratie legionella
Resultaat binnen enkele uren
De noodzaak om de concentratie legionella te beheersen in watersystemen waaruit aerosolen kunnen ontstaan, leidt tot het probleem dat de hiervoor gebruikte kweekmethode (ISO 11731-2017) pas betrouwbare resultaten geeft na een periode van 7-12 dagen. Op basis hiervan kunnen noodzakelijke maatregelen alleen met een aanzienlijke vertraging worden genomen en gecontroleerd. Sneltesten die momenteel op de markt zijn, komen niet overeen met de geaccrediteerde kweekmethode of vergen tijdrovende voorbereidingsstappen. Sommige sneltesten bieden zeer specifieke detectie voor enkele legionella-soorten, maar niet voor alle legionella-soorten in een watermonster (legionella spp. = species pluralis). Het nieuw ontwikkelde meetinstrument INWATROL L.nella+ is gebaseerd op de methode voor het meten van de metabolische activiteit van levende cellen en bepaalt op betrouwbare wijze legionella spp. binnen enkele uren uit een watermonster. Het meetapparaat is direct aangesloten op het watersysteem met automatische en zelfdesinfecterende monstertoevoer, inclusief zelfdesinfectie van het water dat zich in de meetcel bevindt nadat de meting is voltooid. Hierdoor kan de exploitant van de installatie continu en veilig de microbiologische waterkwaliteit bepalen. Naast de directe controle op het succes van de uitgevoerde maatregelen, is het ook mogelijk om b.v. biociden volgens de vereisten te doseren.
1. Inleiding
De relevantie van de verspreiding van pathogene legionella via aerosolen uit verdampingskoelsystemen en koeltorens heeft in veel landen geleid tot het opstellen van technische hygiënerichtlijnen. In veel landen wordt de toelaatbare concentratie van legionella in het circulatiewater van de betreffende installaties beperkt door de wetgever. De basis voor de hygiënecontrole is tot nu toe altijd de bepaling van de concentratie legionella in het water door kweek volgens ISO 11731:2017 met systeemafhankelijke drempelwaarden. Bij deze kweekmethode ontstaan door celdeling zichtbare en dus telbare kolonies. In vergelijking met andere bacteriesoorten delen legionellabacteriën zich relatief langzaam, waardoor de resultaten van de meting pas na 7-12 dagen beschikbaar zijn, waarbij in sommige gevallen nader onderzoek ter bevestiging van verdachte kolonies volgt.
Voor de exploitant van een installatie met monitoringsplicht betekent dit een sterk vertraagde controle van de hygiënestatus. Bovendien kan het effect van eventuele noodzakelijke maatregelen pas met grote vertraging worden bepaald. Aanvullende sneltesten voor het inschatten van de besmetting van water met legionella zijn beschikbaar, b.v. op basis van immunologische reacties (antilichaamreactie), detectie van genetisch materiaal (PCR) of door middel van kleurenfluorescentiemicroscopie. De beperkingen van deze sneltests zijn de kwantificering van levend/dood, de vergelijkbaarheid met de kweekmethode of de complexe monstervoorbereiding.
Het nieuw ontwikkelde en gepatenteerde automatische meetapparaat INWATROL L.nella+ maakt de betrouwbare en continue bepaling van de parameter legionella spp. mogelijk met hoge correlatie met de kweekmethode volgens ISO 11731:2017, binnen enkele uren zonder verdere voorbereidingsstappen door de gebruiker.
2. Sneltest voor de volautomatische bepaling van legionella spp.
2.1 Meetprincipe
De detectie van metabolisch actieve legionella-bacteriën is gebaseerd op een niet-specifieke enzymatische omzetting, die alleen door het celmembraan van levende cellen naar de binnenkant van de cel gaat. De toename van de fluorescentie is functie van de tijd is recht evenredig met het aantal levende cellen en wordt omgezet in kolonievormende eenheden per liter. Door een specifieke voorbehandeling en de hoge meettemperatuur ten opzichte van de kweekmethode wordt de bijbehorende flora gedood. De meting wordt onverdund uitgevoerd in een monstervolume van ca. 350 ml. In vergelijking met de kweekmethode wordt de meting niet significant beïnvloed door randflora en een hoge meetonnauwkeurigheid door een hoge verdunning. Hierdoor is het toestel ook inzetbaar op zwaar beladen waterstromen, zoals afvalwater.
2.2 Continue, geautomatiseerde meting
Voor continumetingen wordt het meetapparaat direct aangesloten op een watersysteem. Een thermisch zelf-desinfecterende monsterlijn zorgt ervoor dat geen enkele reproductie van legionella in de aanvoerleiding het meetresultaat beïnvloedt. Idealiter is de monsternamekraan continu in bedrijf om stagnatie van water tussen twee metingen uit te sluiten. De meetcel in het apparaat wordt tijdens het vullen meerdere keren gespoeld. Nadat het spoelproces is voltooid, begint de voorbehandeling. Wanneer de voorbehandeling is voltooid, koelt de meetcel af tot de meettemperatuur en begint de meting. De meetcel wordt thermisch gedesinfecteerd voordat het apparaat weer wordt gevuld voor het vervolgonderzoek. De meetcel is klaar voor de volgende meting. Gewoonlijk wordt een monsternamekraan direct op het staalnamepunt voor de monsternameleiding geïnstalleerd. Deze kraan kan worden gebruikt om microbiologische monsters te nemen bij het vullen van de meetcel of op elk ander moment, b.v. voor verdere validatiemetingen.
2.3 Geautomatiseerde meting van handmatig geladen monsters
De continumeting kan worden onderbroken voor handmatige toevoer van andere watermonsters via de optionele vultrechter. Voor het reinigen, spoelen en vullen van de meetcel hoeft alleen de klepstand op het apparaat te worden gewijzigd. Wanneer het vullen is voltooid, keert de klepstand terug naar de oorspronkelijke positie en schakelt het meetapparaat terug naar de automatische modus wanneer de meting is voltooid. De meetprocedure zelf verschilt niet van de automatische modus.
2.4 Kweek volgens ISO 11731: 2017
De kweekmethode maakt gebruik van verschillende benaderingen met verschillende verdunnings- en voorbehandelingsstadia (hitte of zuur). Het doel is om evalueerbare resultaten te verkrijgen voor zowel lage als hoge niveaus van legionella. Voor het resultaat wordt het preparaat met het hoogste aantal bevestigde Legionella-kolonies gebruikt (mits de meetnauwkeurigheid / aantal kolonies voldoende hoog is). De grenzen van de nauwkeurigheid van de kweekmethode zijn vooral te wijten aan de mogelijke invloed van de begeleidende flora, d.w.z. andere micro-organismen die de groei van legionella kunnen onderdrukken of hun kolonies kunnen overwoekeren. Bovendien zijn bacteriën deeltjes in een watermonster en zijn ze niet homogeen verdeeld. Daarom kunnen bij het nemen van kleine hoeveelheden uit de monsterfles onnauwkeurigheden optreden vanwege de soms hoge verdunningsfactoren. Tijdens de kweek worden levende maar niet-kweekbare cellen in de zogenaamde VBNC-status niet gedetecteerd. Veel legionella uit een samenhangend agglomeraat, b.v. door voortplanting binnen een amoebe, zijn alleen zichtbaar en geëvalueerd als één kolonie tijdens de teelt.
3. Correlatie van de sneltest INWATROL L. nella + met de kweekmethode
De correlatie van de sneltest werd uitgevoerd over een groot aantal metingen met de kweekmethode volgens ISO 11731: 2017. De bemonstering, het monstertransport en de voorbereiding en evaluatie van de meetresultaten werden uitgevoerd in overeenstemming met de huidige aanbeveling van de Duitse federale milieudienst voor bemonstering en detectie van legionella in verdampingskoelsystemen, koeltorens en natte afscheiders (UBA). Validatiemetingen werden gedaan met verschillende geaccrediteerde laboratoria. Om een betrouwbare kwalitatieve vergelijking tussen de sneltest en de kweekmethode te krijgen, zijn de volgende metingen uitgevoerd in slechts één geaccrediteerd laboratorium (IWW Mülheim an der Ruhr).
4. Bespreking
De correlatie met de in het laboratorium uitgevoerde kweekvoorbereidingen kan in het algemeen als zeer hoog worden beoordeeld. Twee metingen vertoonden op het eerste zicht significante afwijkingen van de laboratoriumresultaten. Hier is de invloed van VBNC-cellen op het meetresultaat van de INWATROL L.nella + sneltest onderzocht. Metabolische activiteitsmetingen worden gebruikt voor de detectie van VBNC-bacteriën. Dit kan een bijkomend voordeel zijn voor de exploitant, omdat herbesmetting van watersystemen met legionella ook het “ontwaken” van VBNC-organismen kan zijn. Vaak is het doel van de operator echter om door middel van teelt in het laboratorium een zo hoog mogelijke correlatie met het wettelijk verplichte onderzoek te bereiken. Door de voorbehandelingsomstandigheden aan te passen kan bij meerdere bevindingen met VBNC-cellen de correlatie met de kweekmethode succesvol worden hersteld.
Door: Jennifer Becker
Fptp’s: Inwatec
